Enzimas.

As enzimas são proteínas com a função específica de acelerar reações químicas nas células. A maioria das enzimas são proteínas globulares (de origem terciárias), excetuando-se as ribozimas, que são enzimas de ribonucleotídeos, as unidades do RNA. As enzimas são os catalisadores mais notáveis, devido as suas propriedades.

Propriedades das enzimas

Catalisam reações nas condições do ambiente celular. As enzimas são capazes de acelerar velocidades de reações nas condições do ambiente celular, ou seja, a uma temperatura de 37o C e pH de 7,4 (valor do pH do plasma sanguíneo). Logo, São influenciadas por pH e temperatura.
São proteínas notáveis, altamente especializadas. Apresentam especificidade por seu substrato. Diferentemente dos catalisadores químicos que não demonstram especificidade por seus substratos, as enzimas são específicas por seus substratos.
Apresentam alto poder catalítico (muito maiores que catalizadores sintéticos). As enzimas podem acelerar velocidade de reações químicas multiplicando-a por fatores de 10^17. Na ausência de enzimas, a maioria das reações biológicas seria tão lentas, que essas reações não ocorreriam nas condições de temperatura e pH das células. As enzimas diminuem a energia de ativação necessária para ocorrer a reação de duas formas:

1. 1. Diminuindo a entropia da molécula (desorganização), fazendo com que a mesma fique em um ponto específico – este ponto é o sitio catalítico da enzima.
  2. A enzima facilita a modificação de grupamentos funcionais da molécula, o que acelera muito a reação.

Apresentam regulação de sua atividade catalítica. As enzimas reguladoras (alostéricas e as enzimas reguladas covalentemente) têm suas ações catalíticas reguladas de acordo com as necessidades metabólicas das células. As moléculas que se ligam à estrutura proteica da enzima alostérica, regulando a sua atividade catalítica são denominados moduladores, efetores ou reguladores. Os moduladores podem ser tanto ativadores quanto inibidores da atividade catalítica.

OBS: atuando de forma organizada catalisam centenas de reações que degradam as moléculas dos nutrientes e conservam suas energias

Doenças ocorrem quando elas não funcionam bem (importância clínica).

Conceitos importantes

CATALISADOR: É toda e qualquer substância que aumenta a velocidade de uma reação, sem ser consumido durante o processo.

ENZIMA: É uma molécula orgânica (proteína ou RNA) que catalisa uma reação química específica.

– Não afeta o equilíbrio da reação

– Aumenta a velocidade da reação

– Diminui a energia de ativação

COENZIMA: são compostos orgânicos, derivados de vitaminas hidrossolúveis.

EX:

1. Coenzima NAD: coenzimas NAD+ e NADP+ , atuam em processos metabólicos de glicídeos e protídeos, na respiração em nível celular. O NAD+ pode se reduzir a NADH+ , ao receber elétrons (na forma de íon hidreto). A forma oxidada, NAD+ , é reciclada pela transferência dos elétrons para a cadeia respiratória, enquanto ATP é produzido.
2. Coenzima (coA): atua no metabolismo de lipídeos (na ativação de ácidos graxos e transporte de grupamentos ácidos) e também no Ciclo de Krebs. É necessária para diversos processos metabólicos celulares como a síntese de hormônios a partir do colesterol; síntese e degradação de ácidos graxos; a formação de anticorpos; a biotransformação e detoxificação de substancias tóxicas.

Catalisadores e velocidade das reações

Como proteínas, as enzimas podem ser também simples e conjugadas, as enzimas conjugadas necessitam de cofatores (moléculas orgânicas (coenzimas) ou inorgânica (cofatores)) para exercer as suas atividades catalíticas. Os cofatores se ligam (transitória e frouxamente) ao sítio ativo da enzima por interações químicas não-covalente, como também podem se ligar (permanentemente) por ligação covalente. Nem toda enzima requer um cofator para exercer a sua atividade catalítica, exemplo desta classe são as enzimas ribonuclease, tripsina, quimotripsina, etc. Os cofatores inorgânicos (cofatores) são normalmente íons metálicos, como Fe2+, Cu2+, Zn2+. O cofator orgânico é denominado coenzima. A porção proteica da enzima conjugada é a apoproteína ou apoenzima. Quando o cofator se liga firme e permanentemente ao sítio ativo da enzima é denominado grupo prostético. Exemplo: o grupo heme da hemoglobina. Desta forma, a enzima conjugada cataliticamente ativa, ou seja, ligada ao seu cofator é denominada holoenzima.

OBS: As coenzimas têm pouca atividade na ausência da enzima e pouca especificidade.

Uma reação química, tal como um reagente ou substrato (S) formando um produto (P) somente formará o produto P, se uma determinada fração das moléculas de S, em qualquer instante considerado, possuir energia suficiente para ser levada ao topo da colina de energia, o estado de transição

A energia de ativação é a quantidade de energia necessária para levar o substrato para o estado de transição. No estado de transição o substrato (S) está num estado ativado, com igual possibilidade dos reagentes (S) formarem os produtos (P) da reação, ou retornarem à condição inicial, não reagindo.

OBS: Para as reações químicas reversíveis (reações que ocorrem nos dois sentidos, ou seja, S produzindo P ou P produzindo S) como a reação em que um substrato S forma um produto P, representada por S ®P, podemos fazer as seguintes observações:

1. 1. Se a reação se dá no sentido de formação do produto P, diz-se que ela é energeticamente favorável, portanto, exotérmica (libera calor para o meio).
  2. Se a reação ocorre no sentido de formação de S, diz-se que ela é energeticamente desfavorável, portanto, endotérmica (absorve calor). Para que uma reação endotérmica ocorra é necessária a adição de energia.

Fatores que alteram a velocidade da reação

concentração do reagente químico

-A velocidade de qualquer reação química é proporcional à concentração de reagentes no estado de transição.

temperatura do meio

– A velocidade de uma reação química pode ser acelerada pela elevação da temperatura da reação. Isso provoca um aumento de colisões entre os reagentes, o que faz com que grande parte deles possua energia interna suficiente para alcançar o estado de transição.

Adição de catalisador

– Direciona as reações, por uma via de mais baixa barreira energética de ativação. Desta forma, os catalisadores diminuem a energia de ativação das reações, permitindo que uma fração muito maior de moléculas de uma dada reação forme produtos por unidade de tempo.

Estrutura do sítio ativo das enzimas

O sítio ativo da enzima é uma fenda, fenestra ou sulco tridimensional localizado na superfície da enzima. É formado pelos grupos das cadeias laterais dos aminoácidos. Os aminoácidos do sítio ativo estão distantes entre si na sequência primária da enzima, mas se aproximam com o enovelamento da cadeia polipeptídica da enzima. Esse enovelamento é o resultado de interações não-covalentes na estrutura terciária (liga o substrato por diversas atrações fracas). O centro ou sitio ativo permite especificidade.

Especificidade das enzimas

A especificidade enzimática é a propriedade das enzimas apresentar preferência por seus substratos.

É derivada da formação de múltiplas interações fracas entre a enzima e a molécula do substrato específico.

OBS: a enzima também se ajusta ao ligante (modelo do encaixe)

Km

Michaelis e Menten deduziram uma constante (KM) que é indicadora da velocidade da reação e consequentemente do grau de afinidade que a enzima tem pelo substrato. A constante de Michaelis-Menten (KM) é definida como a concentração de substrato necessária para que metade da velocidade máxima da reação seja atingida. O KM de um substrato para uma enzima específica é característico, e fornece um parâmetro de especificidade deste substrato em relação à enzima. Quanto menor o KM, maior a especificidade, e quanto maior o KM, menor a especificidade.

OBS: a concentração do substrato afeta a velocidade de reações catalisadas por enzimas.

Vmáx= todos os sítios ativos ocupados
Km = metade da velocidade máx

Enzimas regulatórias

No metabolismo celular, grupos de enzimas trabalham juntos em sequência para conduzir um dado processo metabólico. Nestes sistemas enzimáticos, o produto da reação de uma enzima torna-se o substrato da próxima enzima. Cada via metabólica possui uma ou mais enzimas com maior efeito no ritmo geral do processo, as enzimas regulatórias. Estas enzimas exibem atividade catalítica reduzida ou aumentada, em resposta a certos sinais, controlam a velocidade das reações e assim o ritmo de todo o processo metabólico, permitindo à célula adaptar-se de acordo com as necessidades.

OBS: As enzimas regulatórias controlam a concentração do substrato ou produto (ex: G6P).

# A REGULAÇÃO PODE OCORRER POR:

Regulação alostérica (mudança conformacional) que pode ser positiva ou negativa
Inibição
Modificação covalente
Regulação da expressão gênica

Enzimas Alostéricas

Enzimas alostéricas são enzimas que contém uma região separada daquela em que se liga o substrato (regiões afastadas do centro ativo), na qual pequenas moléculas regulatórias podem se ligar e modificar a atividade catalítica destas enzimas através de uma mudança conformacional na enzima. As modificações no sítio catalítico podem diminuir ou acelerar a velocidade da reação. Muitas enzimas alostéricas estão localizadas em um ponto de ramificação, ou próximo a ele, em uma via metabólica, influenciando no direcionamento de substratos para uma ou outra via disponível. Essas enzimas não seguem a cinética de Michaelis-Menten. Sua curva de saturação é sigmoide em vez de uma hipérbole, assim como a de qualquer proteína alostérica. Normalmente estas enzimas são inibidas pelo produto final da via metabólica (inibição por feedback) Na regulação por feedback (retroalimentação), o produto final de uma rota direta ou indiretamente controla sua própria velocidade de síntese regulação por feedforward (ântero-alimentação), o substrato controla a velocidade da via.

OBS: enzimas alostéricas são aquelas que necessitam de um modulador que se ligue em outro sitio (modulador alostérico) que não o catalítico para aumentar ou diminuir sua atividade. Além disso, esta modulação também pode ser por adição de grupamentos químicos em sítios específicos da enzima.

Quando o modulador alostérico se liga a enzima pode acontecer dois eventos:

SE O MODULADOR FOR +

– Aumenta a velocidade de catalise do substrato (Vmáx) ou,

– Aumenta a capacidade de catalise da enzima (Km)

SE O MODULADOR FOR –

– Altera a conformação da enzima para diminuir a eficiência da catalise pois reduz a afinidade da enzima pelo substrato ou

– Diminui a capacidade de catálise pois diminui a velocidade de reação

Inibidores enzimáticos

Os inibidores de enzimas são moléculas que interferem com a catálise, diminuindo ou interrompendo as reações enzimáticas. Eles se ligam as enzimas, temporária ou definitivamente, impedindo que elas se liguem ao substrato. Muitos tipos de moléculas inibem as enzimas, incluindo drogas, fármacos (muitas terapias por fármacos são baseadas na inibição enzimática), antibióticos, preservativos de alimentos e agentes tóxicos, e podem agir de várias formas. A atividade de inibição enzimática atua como um mecanismo de controle dos sistemas biológicos e são utilizados no desenvolvimento de técnicas para demonstrar a estrutura física e química, e as propriedades funcionais das enzimas.

A inibição da atividade enzimática pode ser de dois tipos:

Reversível (rápida dissociação)

– Competitiva (se ligam ao sítio catalítico e apresentam semelhança ao substrato, diminui a velocidade de catálise)

– Não competitiva (inibidor e substrato podem se ligar simultaneamente a uma enzima)

Irreversível (se dissociam lentamente da enzima- alvo (ligação forte) ex: DIPF (diisopropilfluorofosfato) – atua na acetilcolinesterase, AAS na COX

Inibidores reversíveis

A inibição reversível é caracterizada por uma rápida dissociação do complexo enzima-inibidor. Existem dois tipos de inibição reversível, a competitiva e a não competitiva. O inibidor competitivo se assemelha estruturalmente ao substrato e liga-se ao sítio ativo da enzima, impedindo assim o substrato de se ligar ao mesmo local. Muitos inibidores competitivos tem estrutura similar à estrutura do substrato. Entretanto faltam grupos químicos no inibidor que possam dar continuidade a reação, fazendo com que sua presença apenas gere uma competição com as moléculas do substrato. Um inibidor competitivo diminui a taxa de catálise por reduzir a proporção de moléculas de enzima ligadas a um substrato. Aumenta o Km e não há alteração da Vmáx. Em qualquer concentração do inibidor, a inibição competitiva pode ser diminuída através do aumento da concentração de substrato. Sob estas condições, o substrato compete com o inibidor pelo sítio ativo. Na inibição competitiva, uma enzima pode ligar-se ao substrato ou ao inibidor, mas não a ambos. O complexo enzima-inibidor não gera nenhum produto. (ex: Estatinas (se ligam a HMG-coA redutase, propanol (inibidor beta-adrenérgico) Na inibição reversível não competitiva, o inibidor e o substrato podem simultaneamente ligar-se a uma molécula de enzima em diferentes locais de ligação. Um inibidor não-competitivo se liga a um local diferente do sítio ativo da enzima, pois não há semelhança estrutural entre ele e o substrato. Age induzindo uma mudança conformacional na enzima, diminuindo a taxa de formação do complexo enzima-substrato ou reduzindo a taxa de degradação desse complexo para formar o produto. Enquanto a enzima estiver ligada ao inibidor, nenhum produto será formado. A inibição não competitiva, em contraste com a inibição competitiva, não pode ser superada pelo aumento da concentração de substrato. Na prática, a inibição não competitiva é observada apenas em enzimas com dois ou mais substratos.

Inibidores irreversíveis

Na inibição enzimática irreversível há uma ligação covalente com a enzima, causando uma modificação definitiva no sítio de ligação ou no sítio catalítico da enzima, formando complexos inativos. Também pode atuar destruindo um grupo funcional da enzima que é essencial pra sua atividade ou formando uma associação não covalente estável.

Coenzima na catálise

As coenzimas são complexos de moléculas orgânicas não-protéicas que participam na catálise fornecendo grupos funcionais, muito semelhantes às cadeias laterais dos aminoácidos. Nos humanos, em geral (mas não sempre) elas são sintetizadas a partir de vitaminas. Cada coenzima está envolvida em catalisar um tipo específi co de reação para uma classe de substratos com certas características estruturais. As coenzimas podem ser divididas em duas classes gerais: coenzimas de ativação-transferência e coenzimas de oxirredução.

OBS: As coenzimas têm pouca atividade na ausência da enzima e pouca especificidade

Coenzima de ativação-transferência

As coenzimas de ativação-transferência em geral participam diretamente na catálise pela formação de uma ligação covalente com uma porção do substrato; a porção do substrato fortemente ligada é, então, ativada por transferência, adição de água ou alguma outra reação. A porção da coenzima que forma uma ligação covalente com o substrato é o seu grupo funcional. Uma porção separada da coenzima se liga fortemente à enzima.

OBS: Coenzima A (CoA), biotina e piridoxal-fosfato também são coenzimas de ativação-transferência sintetizadas a partir de vitaminas.

Enzimas de oxirredução

Um grande número de coenzimas está envolvido nas reações de oxirredução catalisadas por enzimas categorizadas como oxirredutases. Algumas coenzimas, como nicotinamida adenina dinucleotídeo (NAD+) e flavina adenina dinucleotídeo (FAD), podem transferir elétrons juntamente com hidrogênio e têm papéis únicos na geração de ATP a partir da oxidação de substratos (combustíveis). Outras enzimas de oxidação-redução

trabalham com metais para transferir elétrons isolados para o oxigênio. Vitamina E e vitamina C (ácido ascórbico) são coenzimas de oxirredução que podem agir como antioxidantes para proteger contra lesão por radicais livres de oxigênio.

OBS: As coenzimas de oxirredução seguem os mesmos princípios que coenzimas de ativação-transferência, exceto que elas não formam ligações covalentes com o substrato.

Cada coenzima tem um grupo funcional único que aceita e doa elétrons e é específico para a forma de elétrons que ela transfere (p. ex., íons hidrido, átomos de hidrogênio,oxigênio). Uma porção diferente da coenzima liga a enzima.

OBS: Como as coenzimas deativação-transferência, as coenzimas de oxirredução não são bons catalisadores sem a participação das cadeias laterais dos aminoácidos da enzima.

OBS: A catálise de reações de oxirredução é realizada por uma classe de enzimas chamadas de oxirredutases. Uma subclasse de oxirredutases recebe o nome comum de desidrogenases (como a lactato-desidrogenase), pois transferem hidrogênio (átomos de hidrogênio ou átomos hidreto) do substrato para uma coenzima aceptora de elétrons, como o NAD+

Papel não catalítico do co-fator

Os co-fatores algumas vezes têm papel estrutural não-catalítico em certas enzimas, ligando juntas diferentes regiões da enzima para formar a estrutura terciária. Eles também podem servir como substratos que são quebrados durante a reação.

PH e temperaturas ótimas

um aumento na velocidade da reação em geral é observado à medida que o pH vai de um nível muito ácido para o espectro fisiológico; uma diminuição da velocidade da reação ocorre à medida que o pH vai do espectro fisiológico para um espectro muito básico.

A maioria das enzimas humanas funciona otimamente em uma temperatura de aproximadamente 37°C. Um aumento de temperatura de 0°C a 37°C aumenta a velocidade da reação por aumentar a energia vibracional dos substratos. A atividade máxima para a maioria das enzimas humanas ocorre próxima a 37°C, pois a desnaturação (perda das estruturas secundária e terciária) ocorre a temperaturas mais altas.

OBS: INIBIDORES ENZIMÁTICOS

Inibidores são compostos que diminuem a velocidade de uma reação enzimática. Os mecanismos de inibição se baseiam em mimetizar ou participar em uma etapa da reação catalítica. O termo inclui análogos do estado transitório e compostos que podem reagir reversivelmente com grupos funcionais no sítio ativo

Inibidores covalentes

Os inibidores covalentes formam ligações covalentes ou ligações extremamente fortes com grupos funcionais no sítio catalítico ativo. Esses grupos funcionais são ativados por suas interações com outros resíduos de aminoácidos e, portanto, é muito mais provável que sejam alvo de fármacos e toxinas do que resíduos de aminoácidos fora do sítio ativo.

OBS: Aspirina® (ácido acetilsalicílico) fornece um exemplo de uma droga farmacológica que exerce seu efeito por acetilação covalente de um sítio ativo de serina na enzima prostaglandina-endoperóxido-sintase (cicloxigenase). A Aspirina® se assemelha a uma porção do precursor da prostaglandina que é um substrato fisiológico para a enzima.

OBS: METAIS PESADOS

A toxicidade por metais pesados é causada pela forte ligação de um metal como mercúrio (Hg), chumbo (Pb), alumínio (AI) ou ferro (Fe) a um grupo funcional de uma enzima. Os metais pesados são relativamente não-específicos para as enzimas que eles inibem, particularmente se o metal for muito tóxico. O mercúrio, por exemplo, se liga a tantas enzimas, frequentemente com grupos sulfidrila reativos no sítio ativo, que tem sido difícil determinar qual das enzimas inibidas é responsável pela toxicidade do mercúrio. O chumbo é um bom exemplo de um metal que inibe pela substituição de um metal funcional normal em uma enzima. Sua toxicidade de desenvolvimento e neurológica pode ser causada por habilidade de substituir Ca2+ em duas proteínas regulatórias importantes no sistema nervoso central e em outros tecidos, Ca 2+ calmo-dulina e proteína-quinase C.

OBS: As enzimas exibem cinética de saturação; sua velocidade aumenta com o aumento da concentração do substrato [S], mas elas atingem uma velocidade máxima (Vx) quando estão saturadas com substrato

OBS: Certas enzimas, cujo local de ação é extracelular (plasma, trato digestivo), são sintetizadas na forma de precursores inativos, chamado zimogênios Para que um zimogênio se torne ativo é preciso que haja hidrólise de determinadas ligações peptídicas, com a consequente remoção de um segmento da cadeia e nova reestruturação espacial da mesma, onde aparecerá um centro ativo funcional; n Várias enzimas proteolíticas (pepsina, quimiotripsina, ..) são sintetizadas e armazenadas como zimogênios, transformadas em enzimas somente fora destas células e no local onde exercerão atividade digestiva.

OBS: A regulação enzimática pode passar ainda pela existência de um precursor, sem capacidade catalítica, que, no caso das proteases, são chamados zimogênios.

Zimogênio–> Clivagem proteolítica –> Enzima ativa

Isoenzimas

A maioria das isoenzimas (ou isozimas) são enzimas que catalisam a mesma reação mas diferem em suas propriedades físicas, e químicas devido a diferenças geneticamente determinadas. Em geral, as isoenzimas estão em diferentes órgãos em concentrações características. EXEMPLO: Creatina quinase (CK), anteriormente denominada CPK (Creatina Fosfoquinase) LDH – lactato desidrogenase TGO – Transaminase glutâmico oxalacética Estas isoenzimas existem no coração, em formas específicas, e podem ser utilizadas para diagnóstico diferencial de injúria do miocárdio. No Fígado, tem-se por ex. a glicocinase IV, que difere das demais hexocinases logo, em tecidos diferentes podem conter isoenzimas diferentes.

As isoenzimas são importantes para diagnósticos.

Aplicação clínica das enzimas

O estudo das enzimas tem imensa importância clínica. Em algumas doenças as atividades de certas enzimas são medidas, principalmente, no plasma sanguíneo, eritrócitos ou tecidos. Todas as enzimas presentes no corpo humano são sintetizadas intracelularmente.

A utilidade diagnóstica da medida das enzimas plasmáticas reside no fato que as alterações em suas atividades fornecem indicadores sensíveis de lesão ou proliferação celular. Estas modificações ajudam a detectar e, em alguns casos, localizar a lesão tecidual, monitorar o tratamento e o progresso da doença. No entanto, muitas vezes falta especificidade, isto é, existem dificuldades em relacionar a atividade enzimática aumentada com os tecidos lesados. Isto porque as enzimas não estão confinadas a tecidos ou órgãos específicos, pois estão grandemente distribuídas e suas atividades podem refletir desordens envolvendo vários tecidos.

Enzimas plasmáticas funcionais (LIPOPROTEÍNA LIPASE, PROENZIMAS DE COAGULAÇÃO)
Enzimas plasmáticas não funcionais (NÍVEIS ATÉ UM MILHÃO DE VEZES MENOR QUE NOS TECIDOS)
Indicadoras de lesão celular e tecidual: aumento da atividade destas no sangue
A distribuição órgão-específica de algumas destas enzimas permite a localização da lesão com bastante precisão