Proteínas de Membrana.

Sumário

Proteínas de Membrana

As proteínas presentes nas biomembranas podem ser classificadas em: Integrais (intrínsecas) ou periféricas (extrínsecas). Esta classificação se baseia no procedimento necessário para promover a dissociação de uma proteína da membrana. Proteínas integrais só se dissociam da membrana através do uso de detergentes, tais como o dodecil sulfato de sódio ou o Triton-X-100, ao passo que proteínas periféricas podem ser dissociadas da membrana na presença de soluções hipersalinas ou soluções de pH extremos. As proteínas periféricas se associam à membrana mediante interações iônicas com proteínas integrais ou com os fosfolipídeos da membrana. Por outro lado, as proteínas integrais da membrana se associam com estas mediante interações hidrofóbicas fortes com os lipídeos da membrana e podem ser subdivididas em três tipos:

a) Proteínas Transmembrana. São proteínas que atravessam completamente a bicamada lipídica, apresentando, pelo menos, três regiões bem definidas: domínio extracelular, domínio transmembrana (TM) e domínio citosólico. Tais proteínas podem cruzar a bicamada lipídica uma única vez (Proteína Integral Unipasso) ou diversas vezes (Proteína Integral Multipasso). A estrutura secundária do domínio TM das proteínas unipasso é sempre α-hélice, sendo este domínio constituído por 20 a 23 resíduos de aminoácidos. As proteínas integrais multipasso podem apresentar domínios TM com estrutura secundária organizada em α-hélice ou folha-β. Nas proteínas multipasso com domínio TM em estrutura α-hélice, é comum observarmos uma ligação covalente à lipídeos do folheto interno, o que promove uma maior estabilidade e interação da proteína com a membrana. Já os domínios TM com estrutura folha-β das proteínas multipasso são constituídos por cerca de 10 resíduos de aminoácidos. Estas proteínas apresentam normalmente de 8 a 22 domínios TM e são encontradas somente em bactérias e nas membranas externas da mitocôndria e de cloroplastos. A interação das proteínas transmembrana com as biomembranas se dá por meio de interações hidrofóbicas entre as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos dos domínios TM das proteínas e a cauda dos ácidos graxos dos fosfolipídeos da membrana.

b) Proteínas Ancoradas por Lipídeos. São quatro tipos de âncoras de lipídeos que promovem a interação destas proteínas com a membrana plasmática: âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI), âncora de miristato, âncora de palmitato e âncora de prenilato. A ancoragem por GPI só ocorre no domínio extracelular da membrana plasmática, enquanto que a ancoragem pelos ácidos graxos é restrita à face citosólica da membrana plasmática. A interação destas proteínas com as membranas se dá pela interação hidrofóbica dos lipídeos ligados covalentemente às proteínas com a cauda dos ácidos graxos dos fosfolipídeos da membrana.

c) Proteínas Ancoradas por α-Hélice. Tais proteínas são ancoradas na membrana plasmática a partir da interação dos fosfolipídeos da membrana com um domínio lateral hidrofóbico em α-hélice da proteína. Estas proteínas são encontradas somente na face citosólica da membrana plasmática.

As proteínas de membrana estão envolvidas em uma série de processos biológicos fundamentais para a fisiologia celular, tais como: transporte de moléculas, atividade enzimática, adesão celular, comunicação celular, reconhecimento celular e formação das junções celulares.

Transporte através das bimembranas

Uma das características mais marcantes das biomembranas é a sua permeabilidade seletiva.

Somente pequenas moléculas não carregadas podem se difundir livremente pela bicamada lipídica. De forma geral, a bicamada lipídica é permeável aos gases, como o dióxido de carbono (CO2), o óxido nítrico (NO) e o oxigênio (O2), por exemplo; às pequenas moléculas de caráter hidrofóbico, como os hormônios esteróides; ou moléculas pequenas polares, mas sem carga, como o etanol. A bicamada é muito pouco permeável à água e praticamente impermeável aos íons e às moléculas maiores, polares ou não, tais como a glicose, lactose, frutose, aminoácidos e nucleotídeos. Como ocorre, então, o transporte destas moléculas através das biomembranas? Conforme discutimos na seção anterior, uma das atividades biológicas das proteínas da membrana é justamente realizar o transporte de íons e molecular através das bicamadas lipídicas, e isto é feito pelas proteínas multipasso. O transporte através das biomembranas é classificado de acordo com a necessidade energética para a realização deste transporte. Assim, temos dois tipos de transporte: passivo e ativo. No transporte passivo não há gasto de energia, uma vez que as moléculas ou íons são transportados do compartimento de maior concentração (da molécula ou íon) para o compartimento de menor concentração. Ou seja, este tipo de transporte ocorre favor do gradiente de concentração e pode ou não ser mediado por proteínas da membrana. Quando o transporte não é mediado por proteínas da membrana denominamos difusão simples e quando o mesmo é mediado por proteínas, ele é denominado difusão facilitada quem facilita? As proteínas, sem as quais esse transporte não poderia ocorrer. A difusão facilitada pode ser mediada por: proteínas carreadoras, como, por exemplo, a proteína GLUT-4, que é o transportador de glicose encontrado no tecido adiposo e muscular cardíaco e esquelético; ou por canais iônicos, que, como o nome sugere, são proteínas envolvidas no transporte de íons através das biomembranas, íons, estes, que apresentam uma distribuição bastante distinta entre o meio extra e intracelular. Os canais iônicos podem ser regulados de diversas formas: por interação com ligantes extracelulares; por interação com ligantes intracelulares, por meio de alterações na voltagem da membrana; ou mecanicamente (estiramento da membrana).

A velocidade do transporte na difusão facilitada depende de uma série de fatores. O caráter químico da molécula a ser transportada é determinante. Para moléculas sem carga, a velocidade de transporte é diretamente proporcional ao gradiente de concentração da molécula, ou seja, quanto maior a diferença na concentração da molécula entre os dois compartimentos separados pela membrana, maior será a velocidade do transporte. No entanto, para íons ou moléculas carregadas, dois fatores são decisivos: o gradiente de concentração e o potencial da membrana, que juntos constituem o gradiente eletroquímico. Moléculas carregadas positivamente por exemplo, são atraídas com maior velocidade para um compartimento com predominância de cargas negativas. No transporte ativo, as moléculas ou íons são transportadas contra o seu gradiente de concentração. Este tipo de transporte requer um gasto energético, uma vez que promove a diminuição da entropia e, conseqüentemente, o aumento da energia livre do sistema. O transporte ativo pode ser dirigido por hidrólise de ATP (trifosfato de adenosina), sendo classificado como Transporte Ativo Primário, ou pode ser dirigido por gradiente eletroquímico, denominado Transporte Ativo Secundário, uma vez que o gradiente eletroquímico utilizado neste tipo de transporte é gerado por um transporte ativo primário dependente do ATP. As proteínas que realizam o transporte ativo primário são conhecidas como ATPases de membrana ou Bombas. Entre estas proteínas podemos destacar: a) a Na+ K+ -ATPase, que, para cada molécula de ATP hidrolisada, realiza o transporte de 3 íons Na+ para o meio extracelular e 2 íons K+ para o interior da célula; b) as proteínas da superfamília ABC (do inglês ATP-binding cassetes), que constituem a maior família de proteínas de membrana, sendo encontradas desde bactérias até seres humanos, e estão envolvidas no transporte de uma série de moléculas, desde hormônios, nucleotídeos, pequenos peptídeos até xenobióticos; c) a bomba de Ca2 da membrana plasmática e da membrana do retículo sarcoplasmático, responsáveis pelos baixos níveis citosólicos deste íon; d) a bomba de próton da membrana lisossomal, que mantém o pH ácido desta organela. No caso dos transportadores secundários, destacamos os trocadores iônicos, o Co-transportador Glicose-Na+ , responsável pela absorção de glicose no trato digestório, e os Co-transportadores de aminoácidos e Na+ . Os transportadores da membrana também podem ser classificados quanto ao tipo e direcionamento do transporte efetuado. Proteínas que transportam uma única molécula, sem gasto energético, são denominadas Uniporte. Já os co-transportadores são denominados Simporte quando transportam uma molécula e um ou mais íons diferentes na mesma direção, ou Antiporte, quando transportam uma molécula e um ou mais íons diferentes em direções opostas. No co-transporte, a passagem de um íon a favor do gradiente de concentração fornece a energia necessária para o transporte acoplado de outro íon, ou molécula, contra o gradiente de concentração.

OBS: Os transportadores ABC estão envolvidos em uma série de patologias humanas, como a resistência à quimioterapia em cânceres, também conhecida como resistência a múltiplas drogas e associada à superexpressão das proteínas ABCB1 (Glicoproteína-P), ABCC1 (Proteína MRP) e ABCG2 (Proteína BCRP). A superexpressão destas proteínas é responsável pela falência terapêutica no tratamento de diversos tumores humanos. Outra patologia humana correlacionada com as proteínas ABC é a fibrose cística, uma doença hereditária autossômica recessiva, onde mutações no gene que codifica para a proteína CFTR, um transportador de íon cloreto, levam a um quadro grave de complicações respiratórias, uma vez que o transporte dos íons cloreto é essencial para a fluidificação do muco.

Endereçamento de Proteínas

Introdução

Os compartimentos intracelulares distinguem-se pela sua morfologia e estrutura e, portanto, possuem um conjunto próprio de ferramentas moleculares para realizarem determinadas funções.

As proteínas são indispensáveis para o desempenho dessas funções (especialização funcional). Excetuando-se algumas poucas proteínas sintetizadas nas mitocôndrias e plastídeos (organelas de vegetais e algas), todas as outras são sintetizadas por ribossomos livres no citosol ou ligados ao retículo endoplasmático.

Uma célula animal típica possui cerca de 10.000 proteínas. Todas precisam chegar ao destino correto para que a célula funcione. Os mecanismos envolvidos no transporte intracelular das proteínas e na sua correta distribuição pelos compartimentos a que pertencem constitui o trafego seletivo de proteínas ou segregação de proteínas.

A síntese de proteínas que são codificadas a partir do genoma nuclear, nos organismos eucariotos, pode ocorrer tanto nos ribossomos livres no citosol quanto nos ribossomos aderidos à face citosólica da membrana do Retículo Endoplasmático Granuloso. Nestes organismos, a síntese protéica também pode ocorrer nas mitocôndrias ou nos cloroplastos, a partir das informações contidas no DNA presente nestas organelas. Como as proteínas que são sintetizadas no citosol são endereçadas aos seus destinos finais¿. A primeira questão que devemos fazer é: como a célula “sabe” para onde uma determinada proteína deve ser endereçada? A resposta é simples: a célula não “sabe”. Bem, mas se a célula não “sabe”, como a proteína chega, então, ao seu destino correto? Quem respondeu a essa pergunta pela primeira vez foi o cientista alemão Günter Blobel no ano de 1970. Blobel verificou que determinadas proteínas apresentavam sequências específicas de resíduos de aminoácidos como parte de sua estrutura primária, e que estas sequências eram responsáveis pelo endereçamento da proteína para um determinado compartimento celular. Estas sequências funcionam como verdadeiros códigos postais biológicos e são conhecidas como sequência sinal ou peptídeo sinal.

A maioria das proteínas são sintetizadas nos ribossomos livres no citosol e muitas permanecem no citosol.

Outras podem ter outros destinos:

– Exportação (via secretora)

– Incorporação em compartimentos intracelulares

– Integração em membranas

Célula Eucariótica

-Cada proteína recém-sintetizada deve ser entregue especificamente ao compartimento onde atuará.

Sequência Sinal

O endereçamento de uma proteína ao seu destino final é crucial para garantir à célula que todos os processos fisiológicos ocorram de forma adequada. As proteínas de localização citosólica são as únicas que não apresentam uma sequência sinal. Tais proteínas são sintetizadas nos ribossomos livres no citosol. As proteínas das mitocôndrias, dos cloroplastos, dos peroxissomos, e do interior do núcleo (nucleoplasma), são sintetizadas nos ribossomos livres no citosol (figura 3.1A). Por outro lado, as proteínas do retículo endoplasmático, do complexo golgiense, dos endossomos, dos lisossomos, das vesículas secretoras e da membrana plasmática, são sintetizadas nos ribossomos aderidos à face citosólica da membrana do retículo endoplasmático granuloso (figura 3.1B). O aspecto granuloso do retículo endoplasmático deve-se justamente à presença dos ribossomos envolvidos na síntese destas proteínas. É nesta região do retículo, conhecida como retículo endoplasmático granuloso (REG), onde ocorre a síntese da cadeia polipeptídica de forma simultânea ao transporte da mesma para o interior do retículo endoplasmático (lúmen do retículo). Diversas sequências sinais já foram descritas. A tabela 3.1 apresenta uma relação de algumas sequências sinais características para o endereçamento para alguns compartimentos celulares, incluindo sequências sinais de retenção de proteínas no retículo endoplasmático e de exportação de proteínas do núcleo para o citosol. Estudos modificando as sequências sinais demonstraram que pequenas alterações nas sequências podem comprometer o endereçamento correto destas proteínas para o seu destino final. Além do mais, a inserção de uma sequência sinal em uma proteína de localização citosólica, pode direcionar esta proteína para um determinado compartimento celular.

Enovelamento das Proteínas

As proteínas para exercerem a sua atividade biológica necessitam adquirir a sua conformação nativa, ou seja, uma estrutura terciária que permita uma interação com o(s) seu(s) substrato(s) e conseqüentemente permita o pleno exercício de sua atividade biológica. O enovelamento de proteínas é o processo pelo qual as mesmas adquirem as suas estruturas tridimensionais funcionais. As proteínas sintetizadas nos ribossomos livres no citosol são enoveladas por proteínas específicas denominadas chaperonas. As chaperonas citosólicas são importantes para prevenirem o dobramento incorreto das proteínas antes do término da síntese e por auxiliarem no enovelamento da proteína para a aquisição da sua conformação nativa Dentro do lúmen do retículo endoplasmático granuloso também são encontradas chaperonas. Estas chaperonas reticulares se ligam em regiões hidrofóbicas de proteínas não dobradas, prevenindo o seu transporte precoce para o complexo golgiense.

Mecanismo de endereçãmento das Proteínas

As proteínas que possuem sequências sinais são endereçadas para os demais compartimentos celulares por meio de três mecanismos distintos: transporte mediado (núcleo), transporte vesicular (complexo golgiense, endossomos tardios, lisossomos e vesículas secretoras) e transporte transmembranar (retículo endoplasmático, mitocôndrias, cloroplastos e peroxissomos).

Transporte Mediado

No transporte mediado, as proteínas que apresentam sequência de localização nuclear (SLN) são endereçadas ao nucleoplasma através do complexo de poros nucleares. Esse transporte é mediado por proteínas especializadas, denominadas importinas, que se ligam especificamente às SLNs, que, ao interagirem com proteínas fibrilares do complexo de poros nucleares, realizam o transporte das proteínas para o interior do núcleo. Algumas proteínas, como determinados fatores de transcrição, apresentam tanto SLN como um sinal de exportação nuclear, circulando, assim, entre o citosol e o nucleoplasma, de acordo com o estado fisiológico da célula.

Transporte Transmembrana

O transporte transmembranar é mediado por proteínas integrais transmembranares presentes nas membranas de determinados compartimentos celulares. Estas proteínas atuam como translocadores protéicos, formando poros, através dos quais as proteínas são inseridas nos compartimentos. Neste caso, as sequências sinais das proteínas interagem diretamente com os translocadores protéicos sem a necessidade de uma proteína mediadora (como a importina, por exemplo). No transporte para as mitocôndrias, por exemplo, complexos protéicos presentes na membrana mitocondrial externa (TOM) e na membrana mitocondrial interna (TIM), além de proteínas solúveis do espaço intermembrana, são responsáveis pela importação das proteínas mitocôndrias. Estas proteínas são enoveladas após a importação para a organela, por intermédio de chaperonas mitocondriais e as suas sequências sinais, de localização amino-terminal, são clivadas por peptidases presentes na organela. De forma diferente, as SLN não são clivadas das cadeias polipeptídicas após a importação das proteínas nucleares. A única exceção no transporte transmembranar de proteínas é o direcionamento para o retículo endoplasmático, uma vez que o transporte ocorre de forma simultânea à síntese protéica na maioria das células eucariontes. Vamos, agora, analisar, com mais detalhamento, como ocorre o transporte para o retículo endoplasmático. Uma vez iniciada a síntese protéica no citosol, caso a proteína apresente uma sequência sinal de localização reticular, uma proteína citosólica solúvel, denominada Partícula de Reconhecimento de Sinal (PRS), se liga à sequência sinal do peptídeo nascente e interrompe a síntese protéica (figura 3.3 – passo 1). O complexo ribossomo/RNAm/peptídeo nascente/PRS é, então, direcionado à face citosólica da membrana do retículo endoplasmático, onde a PRS interage com um receptor presente nesta membrana (receptor da PRS), ancorando todo o complexo traducional na superfície do retículo endoplasmático (figura 3.3 – passo 2). Em seguida, a PRS se desliga do complexo traducional e do receptor da PRS, e o complexo traducional passa a interagir com o translocador da membrana do REG. A síntese protéica, então, se reinicia, com a cadeia polipeptídica sendo inserida para o lúmen do retículo, caracterizando o transporte simultâneo à tradução (figura 3.3 – passo 3). Após o término da síntese, o complexo traducional é desfeito, sendo liberado no citosol, e o translocador sofre mudanças conformacionais que levam ao fechamento do poro na membrana reticular. As proteínas que são sintetizadas nos ribossomos aderidos à membrana do REG podem ter destinos diferentes. Algumas destas proteínas são proteínas solúveis, liberadas no lúmen do REG, e podem ser direcionadas para o complexo golgiense (numa rota conhecida como via de exportação ou via de secreção), sendo, em seguida, endereçadas aos endossomos tardios, às vesículas secretoras ou para a membrana plasmática, onde serão liberadas no meio extracelular. No caso de proteínas solúveis do lúmen do retículo, a sequência sinal é localizada na região amino-terminal da proteína e é clivada por uma peptidase reticular.

A grande maioria das proteínas sintetizadas no REG são proteínas integrais transmembrana, estas proteínas podem ser unipasso ou multipasso. Nas proteínas integrais unipasso a sequência sinal pode estar localizada tanto na extremidade amino-terminal quanto no interior da cadeia polipeptídica. No primeiro caso, a sequência sinal é clivada e uma região predominantemente lipofílica, rica em resíduos de aminoácidos com cadeia lateral hidrofóbica e conhecida como sequência de parada de transferência (SPT), constituirá o domínio transmembrana da proteína. Nestas proteínas, a porção carboxi-terminal ficará exposta no citosol. Quando a proteína apresentar uma sequência sinal interna (SSI), esta sequência, além de direcionar o transporte do complexo traducional para o REG, atuará, também, como uma SPT, sendo que a porção carboxi-terminal da proteína pode ficar voltada para o lúmen do retículo ou para o citosol. A síntese das proteínas integrais multipasso segue a mesma lógica das proteínas integrais unipasso. Os domínios transmembrana de tais proteínas são formados pela intercalação de SSI com SPT. As proteínas integrais unipasso ou multipasso podem seguir os mesmos destinos das proteínas solúveis sintetizadas no REG. É desta forma que são sintetizadas, por exemplo, todas as proteínas integrais transmembrana, que constituem, por exemplo, os receptores de superfície celular e os canais iônicos.

Transporte Vesicular

O terceiro mecanismo envolvido no endereçamento de proteínas é o transporte vesicular. As proteínas que são sintetizadas nos ribossomos aderidos à membrana do retículo endoplasmático, sejam integrais da membrana ou solúveis do lúmen do retículo, podem ter diferentes destinos celulares. A figura 3.4 representa um diagrama com as possíveis rotas para estas proteínas. Independente da destinação celular (ou mesmo extracelular), tais proteínas são transportadas de um compartimento para o outro através de vesículas especializadas. Três vias de transporte vesicular são encontradas nos organismos eucariotos: via de exportação, via de recuperação e via endocítica. A via de exportação tem início no retículo endoplasmático e pode seguir três destinos: a formação dos lisossomos, a secreção constitutiva (SC) e a secreção regulada (SR). As enzimas lisossomais (hidrolases ácidas) são endereçadas aos endossomos tardios (vesículas que recebem o material endocitado do meio extracelular) para constituírem os lisossomos. Na secreção constitutiva, as vesículas, contendo as proteínas sintetizadas no REG, são direcionadas imediatamente para a membrana plasmática, sendo este processo fundamental para manutenção das funções primordiais desta membrana (transporte, sinalização, adesão ou reconhecimento). As vesículas envolvidas na secreção regulada, no entanto, necessitam de sinais extracelulares para liberarem os seus conteúdos no meio extracelular. O aumento dos níveis de cálcio intracelular é responsável pela fusão destas vesículas com a membrana plasmática e conseqüente liberação do conteúdo vesicular no meio extracelular. É através da secreção regulada, por exemplo, que a insulina é liberada pelas células das Ilhotas de Langerhans em resposta ao aumento da glicose na corrente sanguínea.